APRIL阻断剂BCMA-Fc的表达，纯化及活性研究

【摘要】TNF超家族在细胞增殖、分化和死亡中起着十分重要的作用。其主要成员TNFa,TNFb(LTa),LTb,TRAIL,FAS配体等,在免疫调节及免疫应答中的作用已被广泛认识。增殖诱导配体APRIL和B淋巴细胞刺激因子BAFF(又名：B1ys)是TNF配体超家族新近发现的两个关系密切的成员。通过与其受体BAFF-R,BCMA,TACI相互作用,在B淋巴细胞生长、分化和发育,抗体类型转换、生发中心维持以及T细胞共刺激等方面发挥着重要的作用。BAFF/APRIL系统(BAFF,APRIL和它们的受体)在自身免疫性疾病和B淋巴细胞系恶性肿瘤的发生和维持过程中发挥重要的作用。临床研究发现在系统性红斑狼疮,类风湿性关节炎,多发性硬化以及一些恶性肿瘤中,BAFF和APRIL的表达水平升高。BAFF/APRIL系统成为研究自身免疫性疾病药物的新的靶点。利用抗体或欺骗性受体阻断过多BAFF/APRIL成为治疗自身免疫性疾病的有效方法。分子模拟技术为蛋白质的研究提供了一种崭新的手段,在理论上解决了结构预测和功能分析以及蛋白质工程实施方面所面临的难题。它在蛋白质的结构预测和模建工作中占有举足轻重的地位,实现了生物技术与计算机技术的完美结合。通过分子模拟技术设计欺骗性受体BCMA-Fc融合蛋白三维结构模型,通过分子对接预测BCMA-Fc具备结合APRIL的能力。由于毕赤酵母表达系统具有易操作,生长速度快,营养要求低以及表达量高等优点,因此选择毕赤酵母菌种GS115作为目的基因BCMA-Fc的宿主表达菌,选择pPIC9K质粒作为表达载体。实验中发现商业化质粒pPIC9K转化毕赤酵母表达的目的蛋白N末端不均一。这是由于α-factor信号肽序列加工过程中两种信号肽酶Kex2和Stel13作用位点不同造成的。在此基础上重新改造商业化质粒pPIC9K使其表达的目的蛋白的具有原始的,均一的N末端。毕赤酵母表达系统作为真核生物表达系统具有对表达的蛋白翻译后加工和修饰的优点,其中包括对表达外源蛋白过进行糖基化修饰,形成糖蛋白。但是由于修饰后蛋白质的糖链长度不同造成外源蛋白的分子量大小不同。根据毕赤酵母蛋白质糖基化修饰位点的特点,通过目的基因序列与目的蛋白氨基酸序列比对分析后,对目的蛋白糖基化位点基因序列进行点突变形成具有均一分子量的目的蛋白。酵母菌对外源基因的表达与外源基因密码子的选用有关。了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对目的蛋白的基因序列进行密码子优化。优化后基因序列在毕赤酵母中目的蛋白的表达量的显著提高。为了进一步的研究BCMA-Fc的生物活性功能,需要获得大量的目的蛋白,对BCMA-Fc进行毕赤酵母发酵研究和目的蛋白纯化条件的优化。发酵研究中主要针对培养基的组成,诱导方式以及诱导条件(温度,pH)等进行优化,最终通过优化后的发酵条件实现了目的蛋白在毕赤酵母中的高表达。由于BCMA-Fc融合蛋白中具有IgG1Fc片段,可以与ProteinA进行结合利于纯化,提高了纯化的效率。细胞外活性实验显示目的蛋白BCMA-Fc具备配体APRIL结合能力,细胞活性实验说明BCMA-Fc可以阻断APRIL对RajiB淋巴细胞瘤的增殖。实验证明毕赤酵母表达的BCMA-Fc具有完整的生物学活性。为了比较不同表达系统对目的蛋白BCMA-Fc的影响,选择大肠杆菌表达系统对目的蛋白进行表达。大肠杆菌表达目的基因的主要优势：一个是宿主的遗传背景比较清楚,易于控制基因的表达；另一个是大肠杆菌容易培养,可以获得较高产量的目的蛋白。另外,一些改造的大肠杆菌宿主细胞中含有硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶基因利于形成正确折叠的含有二硫键的蛋白,增强蛋白的可溶性。选择pET28a和pET23d质粒作为BCMA-Fc基因的表达载体,并对pET28a质粒进行改造使其作为表达载体进行目的基因表达时增加目的蛋白的可溶性。但是为了适应宿主细胞的要求,选择pET23d作为目的基因的表达载体。构建pET23d-BCMA-Fc质粒,转化大肠杆菌,进行IPTG诱导表达实现了BCMA-Fc的可溶性表达。通过rProteinA亲和层析,分子筛,Q柱进行纯化。细胞外活性检测显示目的蛋白BCMA-Fc具备配体APRIL结合能力,细胞活性实验说明BCMA-Fc阻断APRIL对RajiB淋巴细胞瘤的增殖的作用并且和毕赤酵母表达的目的蛋白BCMA-Fc的细胞活性没有差别。摇瓶表达研究的基础上我们对目的蛋白进行BCMA-Fc大肠杆菌发酵研究,通过20L发酵罐进行LB培养,IPTG诱导表达以及纯化研究。为了进一步研究目的蛋白的活性,我们建立MOG抗原诱导的自身免疫性脑脊髓炎模型检测蛋白活性。实验性自身免疫性脑脊髓炎是研究多发性硬化的经典动物模型,是由同种型、异种型神经组织抗原诱导的中枢神经系统白质免疫炎性脱髓鞘性模型。其病理特征和MS相似,均表现为CNS白质脱髓鞘改变和炎性细胞浸润。对发病的动物模型进行病理学切片分析,HE染色光镜下可见EAE组小鼠脑组织和脊髓组织中有大量的炎性细胞浸润。初步建立了EAE动物模型,并为目的蛋白生物体内活性实验的研究奠定了基础。我们分别利用毕赤酵母和大肠杆菌表达系统实现了达目的蛋白BCMA-Fc的高效表达,进行活性分析显示目的蛋白具有完整的生物活性。成功建立MOG抗原诱导的自身免疫性脑脊髓炎模型,为融合蛋白BCMA-Fc的动物学实验奠定了基础。
【作者】孟宪超；
【导师】于敏；莫炜；汤其群；
【作者基本信息】复旦大学，生物化学及分子生物学，2013，博士
【关键词】增殖诱导配体；B细胞成熟抗原；自身免疫性疾病；发酵；

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